Quadruple isotope dilution versus conventional calibration methods for accurate urinary hippuric acid quantification with a synthesized isotopically labelled material

Abstract

Hippuric acid is a key biomarker in toxicological and metabolic investigations. This study presents an accurate UHPLC-MS/MS method for the quantification of hippuric acid in urine matrix. A quadruple isotope dilution(ID4) strategy was utilized to compensate possible matrix effects and variations in calibration and increase accuracy. Hippuric acid–d₅ was synthesized in-house from glycine and benzoyl chloride–d₅, lowering material costs to easily affordable levels. The mass spectrometry and chromatographic parameters were optimized for improved sensitivity and separation. After the optimization experiments, the analytical performance of the UHPLC-MS/MS system was evaluated. The developed method exhibited a wide linear range from 55.80 ng/ kg to 530.10 µg/kg, with limit of detection (LOD) of 15.6 ng/kg and limit of quantification (LOQ) of 52.1ng/kg. The method was validated with a certified reference material and gradient spiked recovery runs in the same matrix, resulting in excellent agreement with the certified value and consistent recoveries. Results were put into comparison with more conventional techniques of external standard (ES) calibration and single–point isotopically labelled standard addition which demonstrated the superiority of the ID4 method. The proposed method is intended as a candidate reference procedure for hippuric acid in urine, and it can be used to assign values to quality control and calibration materials for routine LC-MS/MS methods. In addition, the in-house synthesis of hippuric acid-d5 makes this approach affordable for laboratories outside metrology institutes.

Hippurik asit, toksikolojik ve metabolik araştırmalarda önemli bir biyobelirteçtir. Bu çalışma, idrar matrisinde hippurik asidin kantifikasyonu için doğru bir UHPLC-MS/MS yöntemi sunmaktadır. Olası matris etkilerini ve kalibrasyondaki varyasyonları telafi etmek ve doğruluğu artırmak için dörtlü izotop seyreltme (ID 4 ) stratejisi kullanılmıştır. Hippurik asit– d₅ , glisin ve benzoil klorür– d₅'den kurum içinde sentezlenerek malzeme maliyetleri kolayca karşılanabilir seviyelere indirilmiştir. Kütle spektrometresi ve kromatografik parametreler, geliştirilmiş hassasiyet ve ayırma için optimize edilmiştir. Optimizasyon deneylerinden sonra, UHPLC-MS/MS sisteminin analitik performansı değerlendirilmiştir. Geliştirilen yöntem, 55,80 ng/kg ile 530,10 µg/kg arasında geniş bir doğrusal aralık sergilemiş olup, tespit limiti (LOD) 15,6 ng/kg ve kantifikasyon limiti (LOQ) 52,1 ng/kg'dır. Yöntem, sertifikalı bir referans materyali ve aynı matriste kademeli olarak eklenen geri kazanım çalışmalarıyla doğrulanmış olup, sertifikalı değerle mükemmel bir uyum ve tutarlı geri kazanımlar sağlamıştır. Sonuçlar, daha geleneksel harici standart (ES) kalibrasyon teknikleri ve tek noktalı izotopik olarak etiketlenmiş standart ekleme yöntemleriyle karşılaştırılmış ve ID 4 yönteminin üstünlüğü gösterilmiştir. Önerilen yöntem, idrardaki hippurik asit için aday bir referans prosedürü olarak tasarlanmıştır ve rutin LC-MS/MS yöntemleri için kalite kontrol ve kalibrasyon materyallerine değer atamak için kullanılabilir. Ayrıca, hippurik asit- d 5'in kurum içi sentezi , bu yaklaşımı metroloji enstitüleri dışındaki laboratuvarlar için de uygun fiyatlı hale getirmektedir.