Quantitative evaluation of NFE2L2/NRF2 and cytokine response induced by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide and nicotine in a titanium-oral mucosa model

Abstract

Objective: Titanium can alter peri-implant mucosa cytokine re sponse to microbiological and chemical stresses. This work used organotypic tita nium-oral mucosa model to evaluate oxidant resistance and cytokine response to Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg LPS) and nicotine. Material and Methods: Seeding gingival keratinocytes on collagen gels with fibroblasts and adding titanium grade (Ti-Gr) 4, Ti-Gr 5, or hydroxyapatite discs developed an organotypic titanium-oral mucosa model. Pg LPS (1 l/mL), nicotine (1.54 mM), or both were given to the model. The Luminex® xMAPTM technology measured in terleukin (IL)-1β, IL-1Ra, IL-8, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and vascular endothelial growth factor levels in culture media. Cultured tissues were paraffin-blocked and immunohistochemistry was used to measure nuclear factor erythroid 2 like 2 (NFE2L2/NRF2), 8-hydroxyguanosine (8-OHdG), and Parkin sonism-associated deglycase (PARK7/DJ-1). Statistical analysis included one-way analysis of varianceand Tukey’s HSD. Results: Nicotine and Pg LPS+nicotine in creased IL-1β and IL-1Ra secretions in Ti-Gr 4, Ti-Gr 5, and hydroxyapatite groups (p<0.01). Pg LPS alone (p<0.01) and in conjunction with nicotine (p=0.021) en hanced MCP-1 production, but nicotine alone lowered it (p=0.024). IL-8 concen trations rose in all test groups (p<0.01). All groups treated with nicotine, LPS, or both showed increased 8-Hydroxydeoxyguanosine and NFE2L2/NRF2 immunos tainings (p<0.01), whereas PARK7/DJ-1 expression remained unchanged. When assessed without inducers, Ti-Gr 4, Ti-Gr 5, or hydroxyapatite groups showed no significant variations in cytokine secretion patterns, NFEL2/NRF2, 8-OHdG, or PARK7/DJ-1 immunostainings (p>0.05). Conclusion: Titanium did not affect cy tokines or oxidant resistance molecules in our organotypic model without induc ers. However, Pg LPS, nicotine, and their mixtures enhance cytokines and oxidative resistance molecules.

Amaç: Titanyum, peri-implant mukozanın kimyasal ve mikrobiyal uyanlara karşı olan sitokin yanıtını değiştirebilir. Bu çalışmada, organotipik titanyum-ağız mukozası modeli kullanılarak Porphyromonas gingivalis lipopolisakkaridi (Pg LPS) ve nikotine karşı oksidatif direnç yanıtının incelenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Organotipik model, fibroblast içeren kolajen jelin üzerine gingival ke ratinositlerin ekilmesini takiben üzerlerine titanyum grade (Ti-Gr) 4, Ti-Gr 5 ve hid roksiapatit disklerin yerleştirilmesi ile oluşturuldu. Uyaran olarak Pg LPS (1 l/mL), nikotin (1,54 mM) veya bileşimleri (Pg LPS+nicotine) modellere uygulandı. Kültür ortamındaki interlökin (IL)-1, IL-1 reseptör antagonisti (IL-1Ra), IL-8, monosit ke moatraktan protein [Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)] ve vasküler en dotelyal büyüme faktörünü seviyeleri Luminex® xMAPTM yöntemi ile ölçüldü. Kültüre edilen örnekler parafin bloklara alınarak, nükleer faktör, eritroid 2 benzeri 2 (NFE2L2/NRF2), 8-hidroksiguanozin (8-OHdG) ve Parkinsonizm ile ilişkilendirilen deglikaz [Parkinsonism-associated deglycase (PARK7/DJ-1)] protein ekspresyon ları immünohistokimya ile analiz edildi. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi ve Tukey’s HSD testi kullanıldı. Bulgular: Ti-Gr 4, Ti-Gr 5 ve hidroksiapa tit gruplarında, nikotin ve Pg LPS+nikotin IL-1β ve IL-1Ra ekspresyonunu arttırdığı görüldü (p<0,01). Pg LPS tek başına (p<0,01) ve nikotin ile kombinasyon halinde (p=0,021) uygulandığında MCP-1 seviyesinde artış gözlemlenirken, tek başına ni kotin varlığında MCP-1 seviyesinde azalma görüldü (p=0,024). Tüm test gruplarında IL-8 konsantrasyonlarının arttığı tespit edildi (p<0,01). Nikotin, Pg LPS veya bun ların kombinasyonun uygulandığı tüm gruplarda 8-OHdG ve NFE2L2/NRF2 ait immün boylamalar daha yoğun iken (p<0,01), PARK7/DJ-1eşit düzeyde gözlem lendi (p>0,05). Her hangi bir uyaran olmadığında Ti-Gr 4, Ti-Gr 5 veya hidroksia patit grupları arasında sitokin seviyeleri ve NFEL2/NRF2, 8-Hidroksideoksiguanozin veya PARK7/DJ-1 immün boyamalarında herhangi bir fark bulunamadı (p>0,05). Sonuç: Organotipik titanyum-ağız mukozası modelinde titanyumun sitokin yanıtı uyarmadığı ve oksidatif direnç moleküllerinin artışına neden olmadığı, ancak Pg LPS, nikotin ve kombinasyonlarının varlığında sitokin yanıtını uyardığı ve oksidatif direnç moleküllerinin ortaya çıkmasına neden olduğu çalışmamızca gösterilmiştir.